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熒光PCR檢測進(jìn)入“分鐘”級時代:百泰克23分鐘RNA檢測技術(shù)
更新時間:2022-09-07   點擊次數(shù):1972次

新冠疫情的爆發(fā),使得全球卷入了這場沒有硝煙的戰(zhàn)斗中


等溫擴(kuò)增



核酸檢測是確診 SARS-CoV-2 感染的最主要依據(jù)。目前可用于 RNA 病毒的核酸檢測技術(shù)主要有基因測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、等溫核酸擴(kuò)增等。其中熒光定量PCR檢測方法是*方案。


然而反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量 PCR(RT-qPCR)的檢測方法需要依賴溫控精度良好的熱循環(huán)儀,并且PCR反應(yīng)中必須的變性、退火和延伸步驟,使整個擴(kuò)增檢測時間較長,難以實現(xiàn)對SARS-CoV-2的現(xiàn)場快速檢測。


核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)無需熱循環(huán)儀,擴(kuò)增反應(yīng)效率高、速度快,非常適合于病原體核酸的現(xiàn)場快速檢測。因此不少相關(guān)從業(yè)人員,都曾把核酸快速檢測的希望,寄托于等溫擴(kuò)增技術(shù)上面。




不同等溫擴(kuò)增技術(shù)優(yōu)劣



不少核酸等溫擴(kuò)增方法已相繼被用于SARS-CoV-2的檢測。包括依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)、交叉引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)(CPA)、切刻內(nèi)切酶核酸擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR)等。


這些技術(shù)原理各異,產(chǎn)物檢測方法各不相同,造成它們在檢測SARS-CoV-2時的靈敏度、特異性、靶標(biāo)基因、所需儀器、檢測時間等方面存在差異。


下圖所示是已經(jīng)獲得國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的主要的核酸等溫擴(kuò)增檢測核酸技術(shù),及其相關(guān)情況:


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數(shù)據(jù)來源:馬學(xué)軍5



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市面上這幾種等溫擴(kuò)增的方法各有優(yōu)缺點,以下來分析




SAT是在 NASBA 技術(shù)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度和特異性,但是并未能從根本上克服NASBA 技術(shù)反應(yīng)時間長的問題。


熒光RT-RAA法熒光RAA方法靈敏度較高。但是對樣品核酸品質(zhì)要求較高,需要搭配傳統(tǒng)的提取方法。并且樣品同一時間只能檢測單一靶標(biāo)基因。


CPA實時熒光法:CPA擴(kuò)增產(chǎn)物采用分子信標(biāo)進(jìn)行檢測,然而這個方法的通量太小。此外交叉引物的設(shè)計要求較高,在研發(fā)過程中,引物的篩選和測試,十分繁瑣。這可能會造成基于該技術(shù)的檢測試劑平臺開發(fā)周期較長。


LAMP芯片法:可利用肉眼觀察顏色變化,或灰度檢測來判讀檢測結(jié)果,雖然降低了對儀器設(shè)備的要求,適合在資源有限和經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)開展核酸檢測,然而主觀判斷顏色變化存在較大個體差異,有可能影響結(jié)果判讀。


此外國外,曾經(jīng)有相關(guān)研究人員就病毒檢測,針對LAMP 實驗方法,以及商品化新冠檢測試劑盒的作一個對比,對不同濃度的陽性樣品進(jìn)行檢測對比,結(jié)果如下表所示:


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結(jié)果顯示在中低濃度的陽性樣品中,LAMP法與熒光定量PCR對比,陽性檢出率較低,而且檢測下限也較差。



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除了上述提到的情況外,等溫擴(kuò)增還有以下一些問題




1、樣品前處理(核酸提?。┦堑葴財U(kuò)增一個主要制約因素。


2、如何實現(xiàn)單管閉管條件下的多重或多靶標(biāo)等溫擴(kuò)增檢測,并同時具有高靈敏度和特異性,也是亟待解決的技術(shù)難題。


3、在理論上等溫擴(kuò)增技術(shù)不能夠通過反應(yīng)時間來指示核酸擴(kuò)增量,這難以實現(xiàn)精準(zhǔn)的定量檢測,更加適合于半定量或定性檢測。


4、某些等溫擴(kuò)增方法,如 LAMP 等溫擴(kuò)增涉及多個引物,往往需要通過優(yōu)化引物設(shè)計來確保核酸檢測的特異性與靈敏度,這提高了其技術(shù)實現(xiàn)難度。


現(xiàn)階段而言,某些等溫擴(kuò)增技術(shù)具有一定現(xiàn)場應(yīng)用的前景,然而目前的產(chǎn)品通量偏低,時間偏長和靈敏度偏低,還是限制了這項技術(shù)的應(yīng)用場景。這些缺點限制了等溫擴(kuò)增的發(fā)展,也造成了等溫擴(kuò)增技術(shù)空有好的設(shè)想?yún)s遲遲無法落地的困境。


那有沒有既兼具了等溫擴(kuò)增快速、儀器簡單的特點,而又有傳統(tǒng)熒光定量PCR特異性好、準(zhǔn)確度高的檢測方法?答案是有的??焖贌晒舛縋CR就是這個問題的解決方法。它既有傳統(tǒng)熒光定量PCR準(zhǔn)確度高,靈敏度好的特點,而又通過技術(shù)革新,具備比等溫擴(kuò)增更快速完成實驗的能力。




革新



傳統(tǒng)的熒光定量PCR實驗時間長,是由于受到儀器升降溫速度,以及傳熱的效率所限,整個實驗時間時長一般為70-120分鐘。


一般來說,熒光定量PCR反應(yīng)的溫度條件是較為固定的,既然無法改變溫度條件,若想提高整個實驗的速度,那么只能從兩方面著手進(jìn)行優(yōu)化:一是提升溫控性能,二是提高熱傳遞效率。


百泰克公司歷時三年研發(fā)的PCR儀,就是從這兩方面入手,打破傳統(tǒng)熒光PCR反應(yīng)時間的枷鎖,為整個熒光定量PCR技術(shù)帶來革新。

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百泰克快速熒光定量PCR儀BTK-8,采用先進(jìn)的升降溫模塊,升降溫可達(dá)12℃/s,平均升降溫速度為10℃/s,為傳統(tǒng)熒光PCR儀的3-5倍。由于變溫PCR反應(yīng)時,溫度需要從58℃提升至95℃,再降至58℃,如此循環(huán)40~45次,因此升降溫速率的提升可將原本70-120min的檢測提速至20~30min完成。


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耗材方面,BTK-8摒棄了傳統(tǒng)的0.1ml、0.2ml PCR反應(yīng)管,采用新型的注塑工藝與柔性膜結(jié)合技術(shù),研發(fā)芯片式反應(yīng)耗材,適合大規(guī)模機(jī)械化生產(chǎn),成本進(jìn)一步降低。


單個芯片包含有10個獨立的樣品孔,芯片加樣孔較小,不容易與空氣進(jìn)行交換,從而大大降低了孔洞間的氣溶膠交叉污染的可能性,檢測體系具有超高的檢測準(zhǔn)確性,可達(dá)到ABI Q6同等靈敏度,且芯片加樣無需離心去掉氣泡,操作起來更加便捷。


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從下表可以看出,現(xiàn)在BTK-8這款快速定量PCR儀,已經(jīng)能把實驗時間壓縮至30分鐘以下,而且檢測下限能夠達(dá)到200 copies/ml,能滿足現(xiàn)在的檢測需求。相比于等溫擴(kuò)增技術(shù),快速熒光PCR的時間更短、準(zhǔn)確性更高。


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結(jié)語



在過去的時間內(nèi),等溫擴(kuò)增技術(shù)憑借其簡單快速、便于在基層單位推廣的特點,在部分人畜共患病、婦科惡性腫瘤、以及多種呼吸道疾病的檢測中發(fā)揮著一定的作用。然而伴隨著BTK-8快速熒光PCR儀的橫空出世,使得相關(guān)的檢測有了一個更好的選擇。能提供更快捷、準(zhǔn)確實驗結(jié)果的快速熒光定量PCR儀,將會替代等溫擴(kuò)增的檢測手段,在多個領(lǐng)域中發(fā)揮巨大作用。


特別是在病毒疫情仍然全球流行的時期,由于各國防控情況不平衡,病毒或?qū)⒃谙喈?dāng)長的一段時間內(nèi)與人類共存,甚至有可能會成為一種長期存在的一種呼吸道傳播病原體。而在口岸快速排查,基層發(fā)熱門診快速分流的實際需求,均要求能夠提供快速、準(zhǔn)確、有效的實驗檢測結(jié)果。相比于等溫擴(kuò)增技術(shù)、BTK-8快速熒光PCR儀則更能滿足這些場景的需求。


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